近年来,能够产生胞外多糖(EPS)的发酵剂的重要性显著增加,例如几种乳酸菌(LAB)。在发酵乳制品中,EPS影响产品粘度和口感。EPS具有较高的水结合能力,对整个体系的粘度影响较大。以分离形式用于食品和制药工业的EPS的例子有右旋糖酐或黄原胶。此外,重要的是要知道,由LAB产生的EPS要么附着在细胞壁上(荚膜EPS),要么释放到周围的培养基中(游离EPS)。
发酵剂的工业生产包括两个主要过程步骤,在特定条件下发酵以及随后从发酵液中分离细菌,这通常是用盘堆离心机完成的。在这里,EPS对发酵液粘度的影响使分离步骤变得困难。另一个复杂的因素是不同的发酵剂通常在同一条生产线上生产,这就是为什么分离条件应该根据各自的菌株进行调整。EPS的特性和类型(游离型、荚膜型或两者都有)对发酵液的粘度有特定的影响,因此对细菌的沉积特性也有特定的影响。经验观察表明,在细胞分离前应用高速剪切均质可改善培养物的沉淀特性,但这种改善也取决于所产生的EPS类型。
本研究的目的是系统地研究高速剪切均质步骤对产EPS的乳酸菌菌株分离性能的影响。
研究了六种不同的嗜热链球菌(ST)菌株,这些菌株在平均细胞链长度和产生荚膜EPS的能力上存在差异(表1)。
表1 未剪切嗜热链球菌荚膜EPS产量和平均细胞链长度
用光学分析离心机(LUMiSizer, LUM GmbH, Berlin, Germany)测量未剪切和剪切样品的沉降速度分布。将稀释样品(与生理氯化钠溶液的比例为1:2)填充到每个样品管中,使用3600 rpm进行测试。采用恒定位置法,在靠近样品管底部的三个径向位置(123、125和127毫米) 用SEPView程序计算沉降速度分布。
使用LUMiSizer测量样品的沉积物压缩。样品管中加入未稀释的样品,LUMiSizer的速度以500 rpm为步阶在1500 rpm和4000 rpm之间变化。
2.1 颗粒沉降速度
图1 在19000rpm下剪切10 s(长虚线)、30 s(短虚线)和120 s(虚线)后,未剪切(实线)细菌菌株ST-D(游离EPS,灰色)和ST-C(荚膜EPS,黑色)的沉降速度分布
由图1可知,未剪切的ST-D沉积速度分布非常广泛,从100 μm/s到近2000 μm/s。这可以归因于细菌形成长细胞链的能力(每链含2-19个球菌,见表1),导致颗粒物体的体积和表观颗粒尺寸增加。由于分布较广,速度的频率分布 (即在相同速度下沉积的颗粒数量的指标)很低。以19,000 rpm的UT速度剪切10秒,快速沉降颗粒的数量减少了,较慢沉降颗粒的数量增加了。结果,最大速度的频率从0.6(未剪切)增加到1.0(剪切)。这反映了剪切作用对细胞链的部分破坏(图2)。随着剪切时间的增加,细胞链被破坏的程度更大,导致沉积速度进一步降低。在19,000 rpm剪切120 s后,平均链长由13个单元减少到6个单元,在沉降速度为300 μm/s时,最大速度分布密度为2.4。
与ST-D相比,剪切后的ST-C沉积速度更高。在120 μm/s左右的沉降速度条件下,未剪切试样的沉降速度主峰值为80 ~ 250 μm/s,最大沉降速度频率为1.4。快速沉降颗粒(可能是细胞链)和缓慢沉降颗粒(可能是细胞碎片或细颗粒)也可见。使用UT在19,000 rpm下剪切10s后,沉降速度分布明显提高。这种变化可以通过检查ST-C产生的荚膜EPS层来解释(见图2未剪切和剪切培养的显微镜图像)。将样品与印度墨水混合,由于墨水颗粒无法渗透到荚膜多糖中,可见在细菌细胞周围呈明亮层。显微镜图像表明,胶囊是在剪切过程中被去除的。由于EPS具有较高的水结合能力,我们假设细胞周围的荚膜EPS层起到了一种摩擦垫的作用,降低了细胞的沉积速度。所以,剪切去掉荚膜EPS层后,沉降速度升高是符合预期的结果。随着剪切时间的增加,沉降速度没有进一步提高,但细胞链断裂明显。剪切120 s后,在沉降速度约为140 μm/s时,最大沉降速度分布密度增大到2.3。这表明在细胞链被破坏之前,荚膜EPS已经被剪切掉。对于产生游离EPS的菌株(ST-E),观察到了类似的结果,即剪切后沉降速度增加,可能是由于发酵液粘度发生了改变。在19,000 rpm的转速下剪切120 s后,无细胞肉汤的表观粘度下降了40%。因此,平均沉降速度由182 μm/s增加到206 μm/s,可以用Stokes定律解释。
图2 ST-D(游离EPS菌株)的显微照片未剪切(左上),在24000rpm下剪切120秒(右上)。ST-C(荚膜EPS菌株)的显微照片(印度墨水进行染色)未经剪切(左下),并在24000rpm下剪切120秒(右下)。
2.2 能量输入对颗粒沉降速度的影响
图3 剪切能输入对细菌细胞沉降速度的影响。应变标识:ST-C,黑色方块;ST-D,黑色圆圈;ST-E,灰色圆圈;ST-G,黑色三角形;ST-H,灰色三角形;ST-I,灰色方块。
图3说明了六种ST菌株的沉降速度存在较大差异,剪切处理在不同程度上影响了沉降速度。沉淀最快的菌株是ST-D,它产生游离EPS并形成最长的细胞链(见表1)。另一种产生游离EPS的菌株ST-E的沉降速度明显低于ST-D,而ST-D的沉降速度又高于四种产生荚膜EPS的菌株。这是将荚膜EPS层解释为减速摩擦垫的另一个原因。对于所有菌株,沉降速度与能量输入呈对数依赖性或几乎保持不变。随着能量输入的增加,产生荚膜EPS的菌株表现为沉积速度增加的趋势,该现象可以通过剪切破坏了菌株周围用于减速的荚膜EPS层来解释。
本研究表明,剪切可以影响发酵培养基中细菌细胞的沉降速度。结果表明:(a)剪切荚膜EPS对沉积速度的影响最大;(b)对于只产生游离EPS的菌株,剪切降低了发酵液表观粘度,从而提高了沉淀速度;(c)长细胞链的破坏导致颗粒尺寸变小,从而导致沉降速度降低。平均沉降速度的比较揭示了这三种影响的组合。由于粘度的变化导致较高的沉降速度,使沉积物形成速度加快,但对沉积物压缩没有影响。细胞链的破坏降低了沉积速度,但由于颗粒尺寸的减小,导致沉积物更加致密。由于剪切作用发酵剂表面的荚膜EPS减少,从而降低了颗粒之间的相互依赖性,因此,导致沉积物的强烈压实,这可能有助于发酵剂生产过程中细胞的分离。
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